貓傳染性腹膜炎的診斷支持現(xiàn)有檢測的最新證據(jù)（2018）

臨床相關(guān)性：貓冠狀病毒（FCoV）感染在貓中非常常見，通常只會引起腹瀉等輕微的腸道癥狀。然而，高達10%的FCoV感染會導(dǎo)致致命的貓傳染性腹膜炎（FIP）。

臨床挑戰(zhàn)：基于非侵入性方法獲得FIP的明確診斷是困難的。該病的確診依賴于發(fā)現(xiàn)與FCoV抗原免疫染色陽性相關(guān)的適當(dāng)細胞學(xué)或組織病理學(xué)變化。在有積液的FIP病例中，對積液樣本進行細胞學(xué)檢查和免疫染色相對容易;否則，獲得診斷樣本更具挑戰(zhàn)性，需要從有大體病變的組織中收集活檢。在沒有明確診斷的情況下，從貓的信號和病史，結(jié)合臨床檢查和實驗室檢查結(jié)果，可以高度懷疑FIP。如果與FIP基本一致，這些結(jié)果可以作為與患者討論是否需要額外的、更具侵入性的診斷測試的基礎(chǔ)。在某些情況下，安樂死可能是作為一種選擇來討論的，而不是在死前進行明確的診斷，特別是如果存在經(jīng)濟限制，或者有人擔(dān)心貓是否能承受侵入性診斷程序。理想情況下，診斷應(yīng)在這類患者的尸檢樣本中得到證實。

全球重要性：只要貓中存在FCoV感染，F(xiàn)IP就會發(fā)生，這相當(dāng)于世界上的大部分地區(qū)。

證據(jù)基礎(chǔ)：這篇綜述全面概述了如何進行FIP的診斷，重點介紹了獸醫(yī)可用的試驗和最近發(fā)表的支持其應(yīng)用的證據(jù)。

什么是冠狀病毒？

冠狀病毒是大型、有包膜、正單鏈RNA病毒，其非節(jié)段基因組長度約為30，000個核苷酸。貓冠狀病毒(FCoV)與犬冠狀病毒(CCoV)一樣，是甲冠狀病毒的一個亞種。冠狀病毒在RNA復(fù)制過程中表現(xiàn)出高突變率，因此作為遺傳多樣性群體的集群存在，稱為準(zhǔn)物種。這種遺傳多樣性，以及與其他冠狀病毒株重組的可能性，與它們的致病性和跨物種傳播有關(guān)。FCoV似乎出現(xiàn)在20世紀50年代，可能是由于跨物種傳播，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)世界各地的貓都感染了FCoV，只有少數(shù)地區(qū)的貓除外，如加拉帕戈斯群島和?？颂m群島，這可能是由于它們偏遠的島嶼棲息地造成的隔離。

FCoV血清型

公認有兩種所謂的FCoV血清型:1型，代表在自然感染的貓中發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)野外毒株，盡管存在地理變異；以及在1型FCoV和CCoV之間的重組事件之后出現(xiàn)的2型。這兩種FCoV血清型主要通過它們的跨膜刺突基因和蛋白質(zhì)的遺傳和血清學(xué)差異來區(qū)分。S蛋白(圖1)很重要，因為它是FCoV與宿主(貓)受體結(jié)合的部分，介導(dǎo)宿主細胞進入。2型FCoV的S蛋白類似于CCoV的S蛋白，并且像CCoV一樣，2型FCoV使用氨肽酶N作為它們的貓宿主細胞受體。1型FCoVs的受體未知。

圖1. FCoV粒子的示意圖。刺突蛋白與貓受體結(jié)合，介導(dǎo)宿主細胞進入。已知貓受體是2型FCoV的氨基肽酶N，但對于1型FCoV尚不清楚。經(jīng)Emi Barker博士許可修改

FCoV與貓傳染性腹膜炎的復(fù)雜關(guān)系

FCoV感染在貓身上很常見。大約40%的家貓感染了FCoV，在多貓家庭中，這一數(shù)字增加到90%。貓科動物飼養(yǎng)的現(xiàn)代趨勢（例如，更多的貓被飼養(yǎng)在室內(nèi)和多貓家庭）可能導(dǎo)致FCoV相關(guān)疾病的增加。

FCoV的自然感染在約70%的貓中是短暫的，但持續(xù)感染發(fā)生在約13%的貓中。這些持續(xù)感染的肛門有時被稱為“攜帶者”或“長期排毒”的貓。在大多數(shù)情況下，F(xiàn)CoV感染是無癥狀的，或只導(dǎo)致輕微的胃腸道臨床癥狀（如食欲不振、腹瀉、嘔吐），盡管有時會出現(xiàn)更嚴重的胃腸道疾病。有趣的是，大約5-10%的貓被認為對FCoV感染有抵抗力。然而，在一小部分病例中，F(xiàn)CoV感染會導(dǎo)致貓傳染性腹膜炎（FIP），這是一種致命的疾病，是幼貓的常見死亡原因。據(jù)報道，偶爾會在多貓家庭或收容所爆發(fā)FIP（當(dāng)更大比例的貓受到影響時），而且最近可能會增加頻率。FIP治療目前是可行的，包括蛋白酶抑制劑在內(nèi)的一些新的治療方法顯示出了希望。

以前認為無癥狀的FCoV感染僅限于腸道，但我們現(xiàn)在知道，健康的FCoV感染的貓可以發(fā)生系統(tǒng)性感染，盡管病毒載量低于FIP貓。

FIP發(fā)展的因素

病毒因子

病毒因子在FIP的發(fā)病機制中很重要。如第228頁的方框所述，F(xiàn)CoV的S蛋白介導(dǎo)宿主細胞進入。S蛋白包含一個推定的融合肽，它能夠使FCoV包膜與宿主細胞膜融合。S基因的突變可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的S蛋白中的氨基酸取代，從而影響FCoV的嗜性。研究已經(jīng)確定了FCoV S基因的融合肽序列中的突變，這些突變被認為是FIP的標(biāo)志，以及密切相關(guān)的弗林蛋白酶切位點的變化，這些變化也被認為與FIP相關(guān)。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)融合肽突變很可能是系統(tǒng)性FCoV感染的標(biāo)志，其可發(fā)生在FIP和非FIP貓中，而不是FIP本身。然而，這些突變?nèi)匀皇侵匾?，因為可能通過這些和/或其他突變，F(xiàn)CoV獲得了其單核細胞/巨噬細胞嗜性，這使其能夠在腸道外全身傳播，并有助于FIP的發(fā)展。

介導(dǎo)單核細胞中有效和持續(xù)復(fù)制的其它病毒因子，以及被感染的單核細胞的活化，對于系統(tǒng)性FCoV感染后FIP的后續(xù)發(fā)展也可能是重要的。

宿主因素

宿主因素也很可能在FIP發(fā)展中發(fā)揮重要作用。這些包括宿主免疫反應(yīng)（例如，發(fā)生FIP的貓會出現(xiàn)T淋巴細胞耗竭）、單核細胞維持FCoV復(fù)制的能力、繁殖和遺傳。

環(huán)境因素

環(huán)境因素，如家庭的壓力水平和過度擁擠，也可能起作用。這些可能會加速單只貓的病毒復(fù)制速度，這可能會增加病毒突變體的產(chǎn)生并支持FIP的發(fā)展。

如何獲取診斷

傳統(tǒng)上，F(xiàn)IP的明確診斷依賴于組織的組織病理學(xué)檢查，通常通過FCoV抗原的免疫組織化學(xué)(IHC)檢測病變內(nèi)的病毒。滲出液樣本中FCoV抗原的免疫染色也是一種選擇，如果滲出液顯示出與FIP一致的生化和細胞學(xué)特征。

組織病理學(xué)檢查、滲出液分析和FCoV抗原免疫染色將在后面詳細討論。

獲得高度懷疑指數(shù)

在缺乏明確診斷的情況下，從背景信息、臨床癥狀和常規(guī)臨床病理結(jié)果中可以獲得高度懷疑FIP的指數(shù)。根據(jù)經(jīng)驗，這可以作為與主人討論是否需要額外的、更具侵入性的診斷檢查(例如，受影響組織的外科活檢)的基礎(chǔ)。在這種情況下，安樂死可能會被討論作為一種選擇，而不是在死前進行明確的診斷；這在例如收容所的貓中可能是優(yōu)選的，在那里存在經(jīng)濟限制，或者當(dāng)貓病得很重并且擔(dān)心患者耐受進一步診斷程序的能力時。

如果在沒有明確診斷的情況下實施安樂死，強烈建議進行死后檢查，且進行起來相對簡單。這樣既可以評估與FIP一致的總體變化(圖2 ),也可以取樣進行組織病理學(xué)檢查。如果經(jīng)濟限制排除了后者，則值得聯(lián)系對FIP感興趣的研究人員(如University of Bristol Feline Coronavirus Research Group and Bristol-Zurich FIP Consortium)，看看是否正在為研究尋找樣本，以便以較低的成本或免費進行分析。

腎臟表面明顯的肉芽腫

脾臟表面可見纖維素性斑塊

腹部可見黃色粘稠積液

網(wǎng)膜上可見纖維素斑塊，同時腸系膜淋巴結(jié)腫大

腸道表面可見的肉芽腫

肺部表面可見的肉芽腫

圖2 .FIP病例典型的大體尸檢結(jié)果。腹腔或胸腔內(nèi)可見器官肉芽腫性病變或器官漿膜上的纖維素性斑塊；適合檢查的組織有腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾、腎和腸表面，以及腹壁和膈肌的腹膜內(nèi)層。在滲出性病例中，可以在胸膜腔和/或腹膜腔中看到黃色粘稠液體，但也可以檢查心包是否有液體。

對于懷疑感染FIP病毒的貓，應(yīng)考慮許多重要的鑒別診斷，如弓形體病、分枝桿菌感染和淋巴細胞性膽管炎。這些疾病和其他疾病在表1中進行了描述，并考慮了這些疾病與FIP病的區(qū)別特征。

FIP的特征和背景證據(jù)

應(yīng)該記住，F(xiàn)IP在幼貓（3歲以下的貓，尤其是2歲以下的小貓）中最常見，但在10歲以上的貓中出現(xiàn)較小的病例峰值。雄貓的風(fēng)險也略高。一些國家的一些品種可能容易患FIP，但這可能是由于這些國家的這些品種存在未知的特定遺傳風(fēng)險因素，并且可能不存在普遍的品種傾向。最近的壓力史（收養(yǎng)、收容所、絕育、上呼吸道疾病、疫苗接種等）可能很明顯，并可能在引發(fā)FCoV感染貓FIP的發(fā)展中發(fā)揮作用。

盡管生活在多貓家庭中會增加FCoV血清陽性的可能性，但最近的一項大型研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)因FIP而被送往醫(yī)院的貓都來自診斷時只有少量貓的家庭。

臨床癥狀

FIP通常表現(xiàn)為一種導(dǎo)致（“濕”）滲出的血管病變（高達80%的FIP病例有滲出），或?qū)е拢ā案伞保┠[塊病變的肉芽腫形成，或兩者的結(jié)合；事實上，大多數(shù)有積液的FIP病例在尸檢時也可見肉芽腫性病變。

滲出性和非滲出性FIP的臨床癥狀(圖3)包括嗜睡、厭食、體重減輕(或年輕貓體重增加失敗/生長遲緩)、發(fā)熱，通常對抗生素或非甾體類抗炎藥等藥物無反應(yīng)，有時還會出現(xiàn)黃疸(在滲出性FIP中更常見)。

最近一項評估有發(fā)熱病史的轉(zhuǎn)診貓病例的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IP是最常見的診斷(20.8%，22/106只貓)，這表明FIP作為該轉(zhuǎn)診貓群體中發(fā)熱貓的鑒別診斷的重要性。另一項僅描述FIP病例的研究報告稱，81%的貓體溫超過39.5°C，39%的貓體溫超過40°C。37與神經(jīng)系統(tǒng)非滲出性FIP相比，滲出性FIP的貓發(fā)熱更為常見。

淋巴結(jié)腫大也可以出現(xiàn)在滲出型和非滲出型FIP中。

滲出性(濕性)FIP可能涉及腹部、胸膜和/或心包(偶爾也發(fā)生在公貓的陰囊)，通常性質(zhì)非常急性，在幾天或幾周內(nèi)發(fā)展，嚴重限制存活。這些貓可能出現(xiàn)呼吸困難、呼吸急促和/或腹部膨脹。

非滲出性（干性）FIP通常與神經(jīng)系統(tǒng)體征（可為局灶性、多灶性或彌漫性，通常伴有中樞前庭體征，偶爾表現(xiàn)為T3-L3脊髓?。┖?或眼部體征（前葡萄膜炎和/或后葡萄膜炎）有關(guān)，并且更為慢性，進展時間為數(shù)周至數(shù)月。干性FIP中也有皮膚病體征（典型表現(xiàn)為小的、多發(fā)的、非瘙癢性丘疹或結(jié)節(jié)）的報道。

腎臟腫大可能發(fā)生在非滲出性FIP并累及腎臟。偶爾會報告彌漫性化膿性肉芽腫性肺炎。

重要的是要記住，F(xiàn)IP的臨床體征會隨著時間的推移而改變，因此重復(fù)的臨床檢查對于發(fā)現(xiàn)新的明顯體征非常重要(例如，少量積液的出現(xiàn)，視網(wǎng)膜檢查可見的眼部變化)。

局灶性非滲出性FIP偶爾發(fā)生，通常表現(xiàn)為可觸摸的腹部腫塊。診斷起來特別困難，因為病變很難與腫瘤和分枝桿菌感染區(qū)分開來。局灶性FIP病例的報告包括貓因壞死性肉芽腫性淋巴結(jié)炎而出現(xiàn)腸系膜淋巴結(jié)腫大，或結(jié)腸或回盲結(jié)腸交界處的孤立性附壁腸道病變伴相關(guān)區(qū)域淋巴腺病。患有局灶性腸FIP的貓有嘔吐和腹瀉的病史。

常規(guī)實驗室檢查可能的結(jié)果

血液學(xué)

FIP的血液學(xué)變化是非特異性的，但有許多異?？梢杂脕碇С衷\斷。淋巴細胞減少癥特別常見（55-77%的病例，盡管最近的一項研究發(fā)現(xiàn)只有49.5%的FIP病例是淋巴細胞減少癥），還報告了中性粒細胞增多癥（39-57%）、左移和輕度至中度正常細胞、正常色素性貧血（37-54%）。最近報道了FIP與微細胞增多癥（伴有或不伴有貧血）之間的關(guān)聯(lián)。嚴重的免疫介導(dǎo)的溶血性貧血（IMHA），以及相關(guān)的再生性貧血，可與FIP一起發(fā)生，但并不常見。

血清生物化學(xué)

FIP病例的血清生物化學(xué)變化是多種多樣的，通常是非特異性的，但有許多重要的異常情況需要尋找來支持FIP的診斷。

高球蛋白血癥

據(jù)報道，89%的病例出現(xiàn)高球蛋白血癥，通常伴有低白蛋白血癥或正常偏低血清白蛋白（64.5%的病例出現(xiàn)）。低蛋白血癥與高球蛋白血癥并存意味著高蛋白血癥可能并不總是發(fā)生；過去的報告記錄了高達60%的病例出現(xiàn)高蛋白血癥，尤其是在干性FIP病例中，但最近報告的發(fā)病率較低，為17.5%。

高球蛋白血癥和低白蛋白血癥或低正常白蛋白濃度的組合也意味著白蛋白:球蛋白(A:G)比低，該參數(shù)可用于評估FIP在個別病例中的可能性。關(guān)于A:G比值在FIP診斷中的有用臨界值的報道各不相同，但有人認為，A:G比值為0.4表明FIP很可能發(fā)生，而A:G比值為0.8則表明FIP很不可能發(fā)生。雖然這些臨界值是有用的考慮，作者沒有使用一個特定的值，但看A:G比與其他診斷測試結(jié)果;該值越低，對FIP的懷疑越大，特別是當(dāng)其他檢查結(jié)果與FIP的診斷一致時。有趣的是，一項對FIP患病率較低的貓群(類似于獸醫(yī)臨床中經(jīng)常遇到的情況)的研究發(fā)現(xiàn)，0.6的A:G比率有助于排除FIP，但較低的比率對判定FIP沒有幫助。

此外，F(xiàn)IP病例中報告的低白蛋白血癥、高球蛋白血癥、低A:G比率和血清蛋白電泳(SPE)異常的頻率和程度最近有所下降。關(guān)于SPE的變化，在一項研究中，2013-2014年診斷為FIP的病例往往具有升高的α2-球蛋白，而不是2004-2009年病例中出現(xiàn)的升高的γ-球蛋白。這可能是由于獸醫(yī)診斷FIP較早，這意味著病例沒有進展到顯示γ-球蛋白升高。多克隆和單克隆γ-球蛋白升高在FIP已有報道，盡管多克隆升高更為常見。

高膽紅素血

高膽紅素血癥發(fā)生在21–63%的FIP病例中，尤其見于滲出性FIP，通常丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)或γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性無明顯升高(盡管在FIP病例中這些酶活性可中度升高)。由IMHA引起的高膽紅素血癥在FIP很少見，貓通常不會嚴重貧血。因此，在沒有升高的肝酶活性或嚴重貧血的情況下，高膽紅素血癥的存在應(yīng)提高對FIP的懷疑指數(shù)(注意，在沒有升高的肝酶活性的情況下，敗血癥和胰腺炎也可引起高膽紅素血癥[表1])。一項研究發(fā)現(xiàn)，通過對患有FIP病的貓進行連續(xù)評估，貓在死亡或安樂死前比首次出現(xiàn)高膽紅素血癥更常見。此外，這項研究還發(fā)現(xiàn)，與首次出現(xiàn)相比，貓在死亡或安樂死前的膽紅素水平更高。

急性期蛋白

在許多炎性和非炎性疾病中，肝臟對巨噬細胞和單核細胞釋放的細胞因子(特別是白細胞介素1和6以及腫瘤壞死因子α)做出反應(yīng)，產(chǎn)生急性期蛋白(APPs)。

α1-酸性糖蛋白（AGP）是一種APP，其測定有助于FIP的診斷。盡管AGP升高（＞0.48 mg/ml）本身對FIP沒有特異性，但在FIP病例中經(jīng)常看到AGP水平顯著升高（＞1.5 mg/ml）。因此，增加的幅度可能有助于FIP的診斷，更高的水平更有助于提高懷疑指數(shù)。一項研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FIP的預(yù)測試概率很高時(即，歷史和臨床結(jié)果支持FIP)，中等血清AGP水平(1.5-2mg/ml)可以區(qū)分患有FIP的貓和沒有FIP的貓。 但是，只有較高的血清AGP水平(> 3 mg/ml)才能支持對疾病預(yù)測概率較低的貓的FIP的診斷(即，病史和臨床發(fā)現(xiàn)不支持FIP)。55然而，另一項非常小的FIP異常病例研究發(fā)現(xiàn)，適度的AGP濃度(> 1.5 mg/ml)仍然能夠區(qū)分FIP和非FIP病例。

FIP的FCoV血清學(xué)

FCoV的血清抗體試驗通常是ELISAs、間接免疫熒光抗體試驗或快速免疫遷移試驗。大多數(shù)使用CoV感染的豬或貓細胞作為底物，并在不同倍數(shù)的血清稀釋液中讀取滴度。FCoV抗體檢測陽性表明貓已經(jīng)感染了FCoV，并且已經(jīng)血清轉(zhuǎn)化(這需要從最初感染開始2-3周)。

已檢測到與品種相關(guān)的FCoV抗體滴度中值差異，這可能反映了品種對FCoV感染反應(yīng)的差異。

盡管FIP貓的FCoV抗體滴度往往高于非FIP貓，但有很多重疊，健康貓和疑似FIP貓中的FCoV病毒抗體滴度中值之間沒有差異。因此，個體動物的滴度在區(qū)分患有FIP的貓方面的用途有限。許多臨床健康的貓（尤其是多貓家庭的貓）的FCoV抗體滴度呈陽性，通常非常高，而約10%的FIP貓的血清呈陰性（這可能是由于樣本結(jié)合抗體中存在病毒，使其無法用于血清學(xué)測試），這突出了解釋的困難。在疑似干型FIP病例中，F(xiàn)CoV抗體陰性結(jié)果可能更有助于排除FIP的診斷；然而，在神經(jīng)系統(tǒng)FIP的病例中已經(jīng)報道了陰性結(jié)果。因此，臨床醫(yī)生在是否對疑似病例進行血清學(xué)檢查方面各不相同，盡管陽性結(jié)果肯定表明接觸了FCoV。

對疑似FIP病例的任何積液樣本進行分析對診斷都非常有幫助，因此獲取積液樣本應(yīng)該是首要任務(wù)。對于胸腔和腹腔內(nèi)少量液體的檢測，超聲檢查通常被認為比放射檢查更敏感，但這可能取決于液體的位置。建議重復(fù)超聲檢查以確定任何少量積液，同樣，超聲檢查可用于引導(dǎo)對少量積液的取樣。

FIP滲出液(圖4)通常是透明的、粘性的、稻草黃色的，富含蛋白質(zhì)(細胞學(xué)上常描述為濃稠的嗜酸性蛋白質(zhì)背景)，總蛋白濃度> 35 g/l(球蛋白> 50%)。偶爾會有乳糜樣滲出。

圖4 .FIP典型的積液表現(xiàn)。積液清澈、粘稠，呈稻草黃色

典型的FIP滲出液具有與血清中類似的低A:G比率（見上文）和升高的AGP濃度。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，在區(qū)分FIP和非FIP病例方面，有效的AGP濃度（>1.55 mg/ml）比血清或其他APPs中的AGP水平更有用（靈敏度和特異性為93%）；然而，在本研究中，貓FIP的“診斷”并不總是通過組織病理學(xué)和免疫染色來證實。

FIP滲出液細胞性差（通常＜5 x 109個細胞/L），本質(zhì)上為典型的化膿性肉芽腫，伴巨噬細胞、非變性中性粒細胞和少量淋巴細胞。因此，根據(jù)細胞計數(shù)(< 5 x 109個細胞/L)，這些通常被描述為改良的漏出液，但根據(jù)蛋白質(zhì)濃度(> 35g/L)，則被描述為滲出液。李凡他試驗(見下圖)是一種簡單的現(xiàn)場檢測方法，可在滲出液樣本上進行，以快速區(qū)分滲出液和滲出液。陽性結(jié)果僅僅意味著液體是滲出液，因此不是FIP特有的；在非FIP病例中報告了陽性結(jié)果(例如，細菌性/膿毒性腸炎和淋巴瘤)。盡管細胞學(xué)有時可以成功地診斷細菌性/膿毒性腹膜炎和淋巴瘤，以幫助區(qū)分這些疾病和FIP病，但許多獸醫(yī)可能沒有信心在院內(nèi)進行細胞學(xué)檢查。

FCoV抗體的血清學(xué)試驗也可以在滲出液樣本上進行，結(jié)果差異很大，因此作者沒有在FIP疑似病例中進行這項試驗。

其他診斷測試

用MRI檢查大腦可能有助于發(fā)現(xiàn)變化。例如，阻塞性腦積水、脊髓空洞、枕骨大孔疝和腦膜、第三腦室、中腦導(dǎo)水管和腦干的顯影增強已在FIP中報道。

腦脊液(CSF)可以從神經(jīng)系統(tǒng)病例中收集，但應(yīng)小心，因為腦疝的風(fēng)險很大。腦脊液可能顯示蛋白質(zhì)濃度升高(> 0.30 g/l腦樣本，> 0.46 g/l腰椎樣本；偶爾FIP貓顯示顯著升高> 2 g/l)和細胞計數(shù)增加(> 8×106細胞/l腰椎和腦樣本；FIP貓的計數(shù)可超過1000 x 106個細胞/l，細胞類型主要為嗜神經(jīng)細胞、單核細胞或混合細胞。一些FIP神經(jīng)系統(tǒng)病例的腦脊液分析結(jié)果并不明顯。CSF樣本也可用于FCoV RNA的RT-PCR和FCoV抗原的免疫染色(見下文)。

FCoV的RT-PCR

RT-PCR試驗可用于FCoV的檢測；然而，它們并不特異于FIP相關(guān)的FCoVs。FCoV RT-PCR分析同時擴增細胞相關(guān)亞基因組mRNA(FCoV復(fù)制時產(chǎn)生的短長度轉(zhuǎn)錄RNA)以及細胞相關(guān)或病毒體相關(guān)基因組RNA，每種RNA的相對豐度由引物的定位決定(即PCR過程中引物沿FCoV序列結(jié)合的位置)。由于病毒轉(zhuǎn)錄始于FCoV基因組的3’端(圖6)，因此含有病毒3’序列的亞基因組mRNA比含有病毒5’序列的亞基因組mRNA多。 因此，針對基因組5’端(如病毒復(fù)制酶復(fù)合物基因)的定量分析(即RT-qPCR)比針對基因組3’端(如7a/b非結(jié)構(gòu)蛋白基因)的定量分析更不易受到病毒載量高估的影響。

圖6.FCoV基因組示意圖。FCoV RT-PCR檢測FCoV RNA。通過不同的RT-PCR擴增的基因組片段根據(jù)測定中使用的引物的位置而變化。由于病毒轉(zhuǎn)錄始于FCoV基因組的3"端，在該3"端產(chǎn)生多個亞基因組RNA，因此使用位于基因組3"端（例如，在M或N區(qū)）的引物進行的PCR檢測將容易受到病毒載量過高估計的影響，因為這些引物將擴增這些亞基因組RNA以及FCoV中存在的基因組RNA。相反，使用位于基因組5"端的引物（如RNA聚合酶）進行的PCR檢測將主要擴增基因組RNA，并且不太容易高估病毒載量。針對FCoV基因組3"端的檢測在檢測FCoV的存在時往往更敏感，因為它們能夠擴增亞基因組和基因組RNA。包括FCoV在內(nèi)的冠狀病毒經(jīng)常發(fā)生突變和重組，這意味著設(shè)計用于特定序列的PCR可能無法擴增所有FCoV。PCRs可以設(shè)計成靶向基因組的保守區(qū)域，以最大限度地減少這種情況，但不可能消除FCoV序列變異性作為非擴增的原因。經(jīng)Emi Barker博士許可修改

實驗室應(yīng)該能夠報告他們用于檢測FCoV RNA的RT-PCR的敏感性和特異性，并且他們使用的引物的結(jié)合位點可以提供一些關(guān)于檢測是否易于高估病毒載量的指示(見上文)。作為一種RNA病毒，F(xiàn)CoV在復(fù)制過程中表現(xiàn)出高錯誤率，并且引物和/或探針結(jié)合位點的任何病毒突變都可能導(dǎo)致PCR檢測效率的損失，并最終導(dǎo)致靈敏度的損失?？梢愿淖働CR條件以耐受這種突變，但這會導(dǎo)致特異性的喪失。

如果所用的實驗室周轉(zhuǎn)時間快，可以快速報告FCoV RNA的RT-PCR結(jié)果；然而，一旦將向?qū)嶒炇姨峤粯颖舅璧臅r間計算在內(nèi)，結(jié)果報告仍需要幾天時間。這通常比組織樣本上的免疫染色更快，并且可能比滲出樣本上的免疫染色更快，但是免疫染色可以提供明確的診斷，而RT-PCR不能。最近已經(jīng)描述了一種用于在內(nèi)部檢測FCoV RNA的快速分子技術(shù)(環(huán)介導(dǎo)等溫擴增),盡管它的靈敏度很低。

哪些樣本可以測試？

RT-PCR可用于檢測疑似FIP病例的組織、積液、血液、CSF或房水樣本中的FCoV RNA（見下框）。組織樣本不應(yīng)被福爾馬林固定，因為福爾馬林會降解靶RNA并降低PCR靈敏度；事實上，RNA對降解非常敏感，用于研究目的的樣本通常被收集到RNA保存液中。然而，RT-PCR用于常規(guī)診斷目的的其他樣品是否需要特殊的收集條件尚未得到證實。血液、積液、組織、腦脊液和/或房水樣本中FCoV RNA的存在（特別是高水平）可以高度支持FIP的診斷，但在作者看來，不能被視為提供明確的診斷。

FCoV RT-PCR也可以對糞便樣本進行，但這主要用于識別正在脫落病毒的貓，以便在多貓家庭中管理感染。糞便FCoV RT-PCR不用于幫助診斷FIP，但有趣的是，最近的研究發(fā)現(xiàn)，患有FIP的貓比沒有FIP的貓更容易脫落FCoV，并且通過RT-qPCR檢測，其糞便中的FCoV RNA含量更高。

表征FCoV S基因突變的分子技術(shù)

可以使用哪些技術(shù)？

在通過RT- PCR檢測到FCoV RNA后，可以使用分子技術(shù)如焦磷酸測序、Sanger測序或具有序列特異性水解探針的PCR來表征樣品中存在的FCoV基因組序列的靶片段。這種技術(shù)并不總是成功的；例如，如果僅存在低水平的FCoV(這可能妨礙序列分析)，或者如果FCoV序列可變性意味著目標(biāo)測序技術(shù)不能產(chǎn)生序列結(jié)果。如果存在FIP特異性突變，F(xiàn)CoV基因組序列的表征將是最有用的，因為這些突變的檢測將有助于診斷FIP。

突變分析有用嗎？

一篇2012年的論文將FCoV S基因編碼的融合肽中的氨基酸差異描述為與FIP相關(guān)的FCoV的標(biāo)記，這增加了檢測潛在的S基因突變可用于明確診斷FIP的可能性。類似地，也由S基因編碼的弗林蛋白酶切割基序中的氨基酸差異與FIP病相關(guān)。然而，這些S基因標(biāo)記是通過比較在FIP貓的組織中發(fā)現(xiàn)的FCoVs序列和在健康的非FIP貓的糞便中發(fā)現(xiàn)的FCoVs序列來識別的。

Bristol的作者小組的研究人員假設(shè)，融合肽序列突變可以反映FCoV的細胞嗜性(即，系統(tǒng)性單核細胞/巨噬細胞相關(guān)的FCoV或腸上皮相關(guān)的FCoV)，而不是FIP的特異性，知道非FIP貓可以有系統(tǒng)性FCoV感染。他們比較了在FIP貓組織中檢測到的FCoV與在非FIP貓組織中檢測到的FCoV的S基因序列，這些序列來自先前描述的融合肽突變區(qū)域。這允許對非FIP和FIP病例中與系統(tǒng)性FCoV感染相關(guān)的FCoVs基因序列進行評估。他們發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)FIP組織中存在的S基因突變也存在于大多數(shù)患有系統(tǒng)性FCoV感染的非FIP貓的組織中。

最近，一項更廣泛的研究證實了這些發(fā)現(xiàn)，并計算出如果將S基因突變的FCoV的鑒定作為RT-PCR檢測FCoV的一個額外的確認步驟，這僅略微增加了組織樣本中FIP診斷的特異性(從92.6%到94.6%)。敏感性中度降低(從89.8%到80.9%)，因為有時會識別出非突變的FCoV，并且不可能在所有組織樣本中進行突變分析(例如，由于FCoV拷貝數(shù)低或存在2型FCoV)。這些結(jié)果質(zhì)疑了S基因突變分析在RT-PCR檢測FCoV之外的價值，特別是考慮到進行這種額外的分析需要額外的費用和時間。

在最近發(fā)表的研究中，也對滲出液進行了S基因突變分析。FIP貓感染的大多數(shù)FCoVs確實有所描述的突變。在一項研究中，12/17的FCoV陽性FIP積液樣本有S基因突變，而1例沒有突變，4例由于FCoV水平低而無法測序。在另一項研究中，32/36 FCoV陽性FIP積液樣本有S基因突變，而3例沒有突變，1例無法測序。

作者小組最近的廣泛研究計算出，作為RT-PCR單獨檢測FCoV的一個額外步驟，S基因突變FCoV的鑒定沒有增加體液樣本(主要是滲出液，但也包括腦脊液和房水)中FIP診斷的特異性——特異性保持在97.9%——但靈敏度顯著降低(從78.4%到60%)，原因與組織樣本中描述的相同。在這項研究中，所有來自FIP貓的FCoV陽性樣本在CSF樣本中都有S基因突變，而非FIP樣本中沒有FCoV陽性。因此，與通過RT-PCR單獨檢測FCoV RNA相比，在FCoV中進行S基因突變分析并不能顯著提高在滲出液或體液樣品中診斷FIP的能力。

組織病理學(xué)檢查

受影響組織的樣本，如肝、腎或腸系膜淋巴結(jié)，可以在死前通過超聲引導(dǎo)經(jīng)皮針芯活檢、腹腔鏡檢查或剖腹手術(shù)收集，盡管收集的侵入性可能會排除在病貓中進行。由于高度懷疑FIP病毒，通常在安樂死后的尸檢中收集樣本。評估樣本的FIP特征性組織病理學(xué)變化，當(dāng)存在時，通常認為診斷是可靠的。FCoV抗原的免疫染色通常也被推薦用于確診。然而，缺少組織病理學(xué)損傷更難解釋，尤其是在懷疑FIP指數(shù)高的病例中，因為缺少指導(dǎo)活檢的大體損傷可能導(dǎo)致未受影響的器官或組織的取樣。最近的一項小型研究記錄了5/8的FIP病例沒有典型的與FIP一致的組織病理學(xué)變化，即使進行了大規(guī)模的代表性活檢；這些病例的診斷基于陽性FCoV抗原免疫染色。

FCoV抗原的免疫染色

免疫染色是使用IHC在福爾馬林固定的組織上進行的，或者使用免疫細胞化學(xué)（ICC）或免疫熒光（IF）在細胞學(xué)（通常是積液）樣品上進行的。這些技術(shù)利用抗體與宿主細胞相關(guān)的FCoV抗原的結(jié)合，隨后通過產(chǎn)生顏色變化的酶促反應(yīng)(ICC)或熒光(IF)來觀察。

組織的FCoV抗原免疫染色陽性被認為證實了FIP的診斷（即，它是非常特異的）；然而，陰性結(jié)果并不排除FIP作為診斷，因為FCoV抗原可能在病變內(nèi)變化分布，因此在從FIP病例的病變制備的所有組織病理學(xué)切片中都沒有檢測到。這在一定程度上與一些人的建議相矛盾，即免疫染色是在可疑病例中確認/排除FIP的強制性規(guī)定，盡管可以通過采集多個和/或大的病理學(xué)確診樣本，以及可能要求切割和染色病理學(xué)活檢的額外切片來克服這個問題。

滲出樣本的免疫染色顯示出不同的敏感性(范圍從57-100%)。由于該技術(shù)依賴于對滲出液中巨噬細胞內(nèi)的FCoV抗原進行染色，并且滲出液通常缺乏細胞和/或FCoV抗原被滲出液中的FCoV抗體掩蓋，因此可能獲得假陰性結(jié)果。免疫染色被認為是非常特異的；然而，在一項研究中，7例非FIP積液中有2例(心力衰竭和膽管癌病例)通過IF呈陽性，在另一項研究中，29例非FIP積液中有82例和8例(包括2例心力衰竭和2例腫瘤)通過ICC呈陽性，這就提出了ICC特異性的問題。報告的較差特異性可能是由于一項研究中使用的方法(即使用FCoV抗原和巨噬細胞雙重染色[通過主要組織相容性復(fù)合體II染色])，以及另一項研究中載玻片的次優(yōu)儲存，這可能導(dǎo)致非特異性染色和假陽性結(jié)果。一些人建議，使用從離心滲出樣品中產(chǎn)生的細胞沉淀來制備福爾馬林固定的石蠟包埋樣品，然后可以像IHC的組織標(biāo)本一樣處理，可以提高FCoV抗原檢測的可靠性，盡管這需要的處理時間比ICC長。

據(jù)報道，F(xiàn)CoV抗原ICC染色成功地檢測了患有神經(jīng)性FIP的貓腦脊液中的FCoV。

最近的一項研究評估了有或沒有神經(jīng)癥狀的有或沒有FIP的貓的腦脊液中的ICC(在死后檢查中收集)。這項研究發(fā)現(xiàn)，17/20的FIP貓給出了陽性結(jié)果，3/18的沒有FIP的貓給出了陽性結(jié)果，這限制了測試的特異性，盡管方法可能再次成為一個問題。這些分析排除了細胞性不足以進行ICC的病例。將ICC應(yīng)用于死前收集的大量因FIP和非FIP引起神經(jīng)癥狀的貓的腦脊液樣本，將有助于進一步評估該技術(shù)的實用性。

FCoV抗原免疫染色的使用最近已在對患有和未患有FIP的貓進行尸檢時收集的房水樣本中進行了描述。該研究評估了25只患有FIP病的貓(有趣的是，其中大多數(shù)為滲出性FIP病例，未出現(xiàn)葡萄膜炎)和11只非FIP貓的房水樣本中的FCoV ICC。靈敏度為64%，特異度為81.8%。在11只對照貓中的兩只中獲得陽性結(jié)果，一只患有淋巴瘤，一只患有肺腺癌；房水細胞學(xué)特征也不符合FIP(化膿性肉芽腫炎癥)。在FIP病例中，能夠使用房水進行可靠的診斷研究將是特別有價值的，因為它可以在非滲出病例中收集房水，盡管本研究中使用的樣本收集技術(shù)需要改進(例如，較小規(guī)格的針頭)以便在死前使用。對從患有由FIP和非FIP原因引起的葡萄膜炎的貓的死前收集的房水樣品的ICC的進一步評估將有助于進一步評估該技術(shù)的有效性。

細針抽吸物也可能用作FCoV抗原免疫染色的樣本，但由于難以靶向病變，敏感性可能較差。需要進一步的研究來評估它們在FIP診斷中的效用，目前沒有證據(jù)支持這一點。

致謝

ST would like to acknowledge the many contribu- tions made by the University of Bristol Feline Coronavirus Research Group and Bristol-Zurich FIP Consortium to the viewpoints and discussions described in this review. Special thanks go to Emi Barker and Samantha Saunders for their helpful comments on this manuscript, and to Jacqui Norris and Anja Kipar for helpful discussions on FCoV antigen staining. Andrew davidson, Anja Kipar and Stuart Siddell are also thanked for their valued contributions to past and current FCoV research. Additional thanks go to the veterinary practices, cat owners, cat breeders and rescue centres that helped in the acquisition of samples used in these research studies and to colleagues, current and past, at the Feline Centre and Veterinary Pathology Unit, Langford Vets, University of Bristol, who have assisted in obtaining samples.

利益沖突

ST is a member of the World Forum for Companion Animal Vector Borne diseases, supported by Bayer Animal Health, and of the European Advisory Board on Cat diseases, supported by Boehringer Ingelheim. She also does work for the Molecular diagnostic Unit, Langford Vets, University of Bristol.

資金

ST receives financial support for current infectious disease research from BSAVA Petsavers, Journal of Comparative Pathology Educational Trust, Langford Trust, Langford Vets Clinical Research Fund, Morris Animal Foundation, NERC/BBSRC/MRC, Petplan Charitable Trust, South West Biosciences dTP and Zoetis Animal Health.